以技術(shù)創(chuàng)新最小化CAR-T生產(chǎn)中的細(xì)胞損耗

隨著CAR-T療法獲批上市，優(yōu)化CAR-T細(xì)胞生產(chǎn)工藝成為迫切需求，市場(chǎng)急需更高效、成本更低的細(xì)胞生產(chǎn)工藝。2017年全封閉自動(dòng)化CAR-TXpress™系統(tǒng)正式進(jìn)入CAR-T市場(chǎng)，為全球帶來(lái)新一代CAR-T生產(chǎn)工藝，可實(shí)現(xiàn)CAR-T細(xì)胞高效率、低成本生產(chǎn)，備受矚目。近日，《CELL & GENE THERAPY INSIGHTS》雜志采訪了這項(xiàng)創(chuàng)新技術(shù)平臺(tái)的主要發(fā)明者Philip H Coelho，深入了解新一代CAR-T生產(chǎn)工藝CAR-TXpress™。

Philip H Coelho

Philip H Coelho先生是博雅控股集團(tuán)旗下熱動(dòng)力醫(yī)療（ThermoGenisis, 納斯達(dá)克股票代碼：KOOL）的首席技術(shù)官(CTO)。他是一位工程師，也是一位發(fā)明家，已獲得40多項(xiàng)與細(xì)胞分選、細(xì)胞清洗、自動(dòng)化細(xì)胞凍存、低溫自動(dòng)化機(jī)械技術(shù)、血液內(nèi)凝血蛋白的收集相關(guān)的美國(guó)專(zhuān)利。

在職期間， Coelho先生開(kāi)發(fā)了Thermoline超快速血漿冷凍機(jī)和解凍機(jī)、CryoSeal自動(dòng)化系統(tǒng)（將手術(shù)患者血液制成纖維蛋白膠）、BioArchive®機(jī)械系統(tǒng)（用于胎盤(pán)/臍血造血干細(xì)胞及祖細(xì)胞（HSPC）的程序降溫和低溫凍存）以及AutoXpress®系統(tǒng)（將臍血中的HSPC無(wú)菌自動(dòng)收集至25ml雙室冷凍袋）。BioArchive®系統(tǒng)以及AutoXpress®系統(tǒng)已在全球樹(shù)立臍血處理以及存儲(chǔ)的GMP最高標(biāo)準(zhǔn)。

9年來(lái)，Coelho先生與其工程師和細(xì)胞生物學(xué)家精英團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了符合GMP規(guī)范的新一代可編程系統(tǒng)，能提高從外周血、胎盤(pán)/臍帶血、骨髓和白細(xì)胞產(chǎn)品中分離純化干/祖細(xì)胞和免疫細(xì)胞的速度和效率。這些研究項(xiàng)目演化成為CAR-TXpress™技術(shù)平臺(tái)，這是一種自動(dòng)化、全封閉的生物制造平臺(tái)，能夠大規(guī)模生產(chǎn)高質(zhì)量、臨床級(jí)CAR-T細(xì)胞。

Q：CAR-T生產(chǎn)工藝中哪些環(huán)節(jié)可以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化或半自動(dòng)化？

Coelho先生：CAR-T細(xì)胞生產(chǎn)工藝的關(guān)鍵環(huán)節(jié)可以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，現(xiàn)如今行業(yè)迫切需要推進(jìn)生產(chǎn)自動(dòng)化。值得注意的是，每一次的白細(xì)胞去除術(shù)（leukapheresis）都能從健康供體中獲取約5×10⁹個(gè)T細(xì)胞。這個(gè)數(shù)量遠(yuǎn)高于實(shí)際注入患者體內(nèi)的基因修飾T細(xì)胞的數(shù)量（諾華Kymriah™：0.2-5×10⁶/kg，凱特Yescarta™：2×10⁶/kg）。更讓人擔(dān)心的是，采用當(dāng)前手工生產(chǎn)工藝，可輸注的T細(xì)胞數(shù)量會(huì)隨著一周或更長(zhǎng)的擴(kuò)增周期而大量損耗。

整個(gè)工藝流程均會(huì)發(fā)生關(guān)鍵細(xì)胞損耗，但最嚴(yán)重的可能發(fā)生在第一階段——從患者血液中收集單個(gè)核細(xì)胞（MNC），進(jìn)行T淋巴細(xì)胞分離。常年在實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn)CAR-T細(xì)胞的專(zhuān)業(yè)人員告訴我們，當(dāng)前的手工工藝可導(dǎo)致細(xì)胞損耗率高達(dá)50%至90%，因此將此生產(chǎn)環(huán)節(jié)自動(dòng)化尤為重要。

優(yōu)良的自動(dòng)化工藝應(yīng)能夠在去除血小板、紅細(xì)胞、粒細(xì)胞以及清洗冷凍保護(hù)劑二甲亞砜（DMSO）的同時(shí)，將MNC損耗最小化，獲取純化的MNC，從而有效分選T細(xì)胞。成功的自動(dòng)化系統(tǒng)還需要克服因不同來(lái)源的患者血液所帶來(lái)的嚴(yán)重并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)（現(xiàn)采或凍存的外周血或白細(xì)胞去除術(shù)的產(chǎn)品）。

下一個(gè)需要自動(dòng)化的環(huán)節(jié)是從MMC中分選T淋巴細(xì)胞。自動(dòng)化分選必須獲取高純度T細(xì)胞，以求最大限度提高下游處理效率。抗體分選后殘余在T淋巴細(xì)胞群中的單核細(xì)胞會(huì)降低轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和T細(xì)胞的擴(kuò)增。此外，如果單核細(xì)胞殘余量較大（常發(fā)生于傳統(tǒng)磁珠分離過(guò)程），采用人工方法清除這些單核細(xì)胞亦無(wú)法避免目標(biāo)T細(xì)胞再次損耗。

獲取高純度T細(xì)胞后，優(yōu)良的自動(dòng)化激活工藝可避免再次引發(fā)并發(fā)癥。例如，某些用于激活的磁珠產(chǎn)品本身就是個(gè)大問(wèn)題，為此FDA要求臨床醫(yī)師在清洗前后對(duì)磁珠進(jìn)行計(jì)數(shù)（磁珠數(shù)量常大于需要激活的細(xì)胞量）。當(dāng)然，F(xiàn)DA不希望與細(xì)胞大小相同的磁珠隨細(xì)胞輸入患者體內(nèi)。

Q：您對(duì)企業(yè)采用自動(dòng)化設(shè)備有何建議，理想情況下，這種投資何時(shí)能見(jiàn)到回報(bào)？

Coelho先生：如果是生產(chǎn)小部件，那么簡(jiǎn)單的投資回報(bào)（ROI）分析就可以。但我們并不是在生產(chǎn)小部件,而是在努力收集足量具有可行性的基因修飾T細(xì)胞，用來(lái)拯救生命，因此患者的生存率才是分析的關(guān)鍵。當(dāng)然，硅谷制造模式值得參考：制造商升級(jí)芯片自動(dòng)化生產(chǎn)工藝后，生產(chǎn)效率高、生產(chǎn)成本降低，同時(shí)產(chǎn)品質(zhì)量也得以提升。

然而，芯片制造商是不會(huì)遇到生物制藥領(lǐng)域這種復(fù)雜問(wèn)題的——患者提供的原始細(xì)胞在數(shù)量和質(zhì)量上差異很大，生產(chǎn)設(shè)備的各個(gè)自動(dòng)化環(huán)節(jié)需要在降低目標(biāo)成本的同時(shí)，既要縮短生產(chǎn)耗時(shí)，又要提升細(xì)胞回收率、活率、純度及穩(wěn)定性。

目前，將患者細(xì)胞輸入自動(dòng)化生產(chǎn)設(shè)備系統(tǒng)后，我們并不能隨即從設(shè)備另一端口輕易獲取可用于治療的CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品。但是，在生產(chǎn)工藝流程中系統(tǒng)地引入自動(dòng)化模塊將能簡(jiǎn)化現(xiàn)有生產(chǎn)工藝，從而更易實(shí)現(xiàn)整個(gè)工藝流程的全自動(dòng)化。

Q：與非自動(dòng)化制造方法相比，CAR-TXpress™系統(tǒng)性能如何？

Coelho先生：我們相信，與傳統(tǒng)手工生產(chǎn)系統(tǒng)相比，我們的自動(dòng)化模塊將在MNC純化、細(xì)胞清洗、抗體分選以及T細(xì)胞激活方面表現(xiàn)更佳，并且大幅縮短處理時(shí)長(zhǎng)。

有文獻(xiàn)指出，采用Ficoll法從外周血中分離MNC，目標(biāo)MNC的損耗率大于30%，且耗時(shí)近

4小時(shí)。我們的自動(dòng)化、全封閉系統(tǒng)X-LAB ™系統(tǒng)在30分鐘左右即可實(shí)現(xiàn)MNC回收率大于90%，同時(shí)去除紅細(xì)胞、粒細(xì)胞以及血小板。

文獻(xiàn)還指出，采用常規(guī)手工工藝或是第一代機(jī)械化工藝清洗已復(fù)蘇白細(xì)胞產(chǎn)品導(dǎo)致T細(xì)胞損耗率高于30%。相反，自動(dòng)化、全封閉系統(tǒng)X-WASH™能實(shí)現(xiàn)冷凍保護(hù)劑二甲亞砜（DMSO）去除率保持在99%以上，且T細(xì)胞損耗率低于10%，這比傳統(tǒng)磁珠分離法高出10%至15%的水平。

我們的試驗(yàn)證明，在生產(chǎn)工藝下游的擴(kuò)增環(huán)節(jié)，經(jīng)微泡激活的細(xì)胞可保持活性,并且擴(kuò)增效果優(yōu)于傳統(tǒng)磁珠技術(shù)分選獲取的T細(xì)胞的擴(kuò)增效果。與現(xiàn)有手工技術(shù)相比，我們自主研發(fā)的模塊式自動(dòng)化技術(shù)每個(gè)工藝環(huán)節(jié)預(yù)計(jì)至少分別提升效率10-20%。

現(xiàn)階段我們的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)基本都來(lái)自健康供體細(xì)胞，預(yù)計(jì)不久的將來(lái)我們就能取得真實(shí)患者提供的細(xì)胞，從而獲得最新的比較數(shù)據(jù)。提取患者大量細(xì)胞進(jìn)行新技術(shù)測(cè)試的確頗具挑戰(zhàn)。這些重度患者最需要的是將活細(xì)胞盡多用于CAR-T治療，而非研究。然而，我們正在與凍存了“過(guò)量”患者細(xì)胞的機(jī)構(gòu)合作，這些機(jī)構(gòu)會(huì)不定期地因患者在細(xì)胞進(jìn)行處理前不幸地去世，或因患者提供了超過(guò)所需的數(shù)量，而留下過(guò)剩的細(xì)胞。鑒于這些細(xì)胞來(lái)自重癥患者且已凍存，接下來(lái)的幾個(gè)月內(nèi)我們能夠用這些最真實(shí)的細(xì)胞對(duì)我們的技術(shù)進(jìn)行測(cè)試，希望所獲數(shù)據(jù)與健康捐贈(zèng)者細(xì)胞試驗(yàn)數(shù)據(jù)一致。

Q：這個(gè)設(shè)備平臺(tái)是否具有可擴(kuò)展性？是否需要大量定制？

Coelho先生：CAR-TXpress™平臺(tái)設(shè)備可擴(kuò)展，無(wú)需大量定制。事實(shí)上，我們?cè)O(shè)計(jì)的每個(gè)模塊（X-LAB™, X-WASH™ 或 X-BACS™），都只需要對(duì)其控制模塊進(jìn)行編程。例如，如果需要純化MNC，僅需將控制模塊的程序根據(jù)原材料（即白細(xì)胞或外周血）稍作修改。一旦控制模塊進(jìn)行了編程，CAR-TXPress™系統(tǒng)將持續(xù)重復(fù)這個(gè)程序。

為進(jìn)行擴(kuò)展測(cè)試，我們?cè)诋?dāng)?shù)匾粋€(gè)GMP細(xì)胞處理實(shí)驗(yàn)室做了一組對(duì)比試驗(yàn)。將外周血分成兩份等量樣本，其中一份樣本交由熟練技術(shù)員采用Ficoll法及磁珠法來(lái)分離并激活T細(xì)胞；將另一份樣本交由熟練技術(shù)員使用X-LAB™和X-BACS™技術(shù)進(jìn)行T細(xì)胞分離與激活，兩組技術(shù)員同時(shí)開(kāi)始操作。結(jié)果，第一組技術(shù)員用Ficoll法剛完成MNC純化，采用CAR-TXpress™系統(tǒng)的技術(shù)員已經(jīng)完成MNC純化、分選，并已激活CD3+細(xì)胞。

我們特地將CAR-TXpress™設(shè)計(jì)為模塊化系統(tǒng)，因?yàn)槟K化系統(tǒng)本身可以為企業(yè)有效控制成本，而非“瑞士軍刀”集成設(shè)備那般造價(jià)昂貴。采用模塊化平臺(tái)，便于自主設(shè)計(jì)高效工藝流程。

此外，MNC純化、分選和激活環(huán)節(jié)如果能夠顯著減少T淋巴細(xì)胞的損耗，完成轉(zhuǎn)導(dǎo)后則可對(duì)已修飾T細(xì)胞進(jìn)行簡(jiǎn)單沖洗，將之輸注患者體內(nèi)，使其在體內(nèi)擴(kuò)增。如果這種方法得到臨床驗(yàn)證，則可大幅縮短從T細(xì)胞收集到臨床注射CAR-T細(xì)胞的時(shí)長(zhǎng)。

Q：CAR-TXpress™系統(tǒng)不用Ficoll法或磁珠法分離和分選細(xì)胞，那么它的基本原理是怎樣的呢？

Coelho先生：Ficoll密度梯度分離法常用于從外周血或白細(xì)胞中分離純化MNC，且已沿用40余年，采用手工操作，耗時(shí)長(zhǎng)且效率低。所有實(shí)驗(yàn)技術(shù)員都用過(guò)這種方法。相信貴刊的很多讀者也都意識(shí)到這種方法的種種缺陷。對(duì)于需要CAR-T治療的患者而言，目標(biāo)MNC在生產(chǎn)工藝的第一環(huán)節(jié)就損耗了30%至60%，其中約50%為T(mén)淋巴細(xì)胞，這些損失無(wú)法挽回，也不應(yīng)讓急需CAR-T細(xì)胞治療的患者承擔(dān)。

磁珠法用于分離MNC中的T淋巴細(xì)胞，已沿用約25年，確實(shí)很有價(jià)值。然而，使用此方法規(guī)模化生產(chǎn)細(xì)胞以大面積供應(yīng)患者群體時(shí)，其表現(xiàn)出來(lái)的低產(chǎn)能、低細(xì)胞回收率及低純度會(huì)帶來(lái)許多挑戰(zhàn)。此外，正如前面所說(shuō)的，用于激活的一些磁珠產(chǎn)品本身就存在問(wèn)題（磁珠的量通常比激活細(xì)胞的數(shù)量還要多），以至于FDA要求臨床醫(yī)生在細(xì)胞清洗前后對(duì)磁珠數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)。

相反，我們?cè)O(shè)計(jì)的脂質(zhì)殼微泡在細(xì)胞分選激活后便被釋放出來(lái)。轉(zhuǎn)導(dǎo)擴(kuò)增后，殘余物質(zhì)經(jīng)洗滌自動(dòng)去除。

Q：能否請(qǐng)您描述BACS的工作原理，告訴我們它與其他細(xì)胞分離法有何不同之處？

Coelho先生：我們的浮力激活技術(shù)（BACS）利用脂質(zhì)外殼、鏈酶親和素包裹氣泡，氣泡直徑2-3微米，與生物素化抗體結(jié)合來(lái)選擇、激活、或同時(shí)選擇激活靶細(xì)胞，如T淋巴細(xì)胞。

美國(guó)FDA非常了解微泡，并且批準(zhǔn)在診斷造影技術(shù)中使用微泡。微泡可從任何部位直接輸入至患者血管，分散到全身，采用恰當(dāng)?shù)某曅盘?hào)能使微泡在體內(nèi)爆破，從而傳播信號(hào)，呈現(xiàn)出附近組織的影像，使臨床診斷醫(yī)生可以無(wú)創(chuàng)地“觀察”該組織。

常規(guī)細(xì)胞分選技術(shù)利用涂有抗體的磁珠來(lái)附著表面帶有抗原的靶細(xì)胞，然后通過(guò)磁場(chǎng)環(huán)境來(lái)捕獲靶細(xì)胞。采用該技術(shù)，無(wú)論是靶細(xì)胞還是非靶細(xì)胞都向下流經(jīng)具有磁場(chǎng)的狹窄通道。未附著磁珠的非靶細(xì)胞通過(guò)該通道時(shí)進(jìn)入特定容器被清除。然而，靶細(xì)胞與非靶細(xì)胞的細(xì)胞混合物也會(huì)被磁場(chǎng)通道吸附，這也是該方法的局限性。因?yàn)椴东@的細(xì)胞群中存在著非靶細(xì)胞，從而降低了終產(chǎn)物中的靶細(xì)胞純度，且需要在轉(zhuǎn)導(dǎo)和T細(xì)胞擴(kuò)增前增設(shè)工藝環(huán)節(jié)去除污染的單核細(xì)胞。

相反，CAR-TXpress™技術(shù)使用微泡/抗體復(fù)合物與靶細(xì)胞結(jié)合，改變了整體密度，離心分離時(shí)，非靶細(xì)胞下沉，靶細(xì)胞輕輕上浮，往非靶細(xì)胞相反的方向聚集（圖1）。

圖1：X-BACS™的工作原理

此外，我們的設(shè)備進(jìn)行自動(dòng)化處理所采用的特殊圓柱器皿帶有錐形處理倉(cāng)（見(jiàn)圖1）。離心過(guò)程中，附著微泡的靶細(xì)胞緩緩上升至血漿上表層，T細(xì)胞回收率大于85%，單核細(xì)胞的去除率高于99%。

這非常重要，因?yàn)槌醪教幚憝h(huán)節(jié)留下的T細(xì)胞無(wú)需再用昂貴耗時(shí)的工藝進(jìn)行擴(kuò)增。如果需要激活T細(xì)胞，可將CD3+和CD28+抗體同時(shí)與微泡結(jié)合（圖2），這也是X-BACS™技術(shù)的另一個(gè)重要特性。

圖2

我們認(rèn)為，較傳統(tǒng)磁珠技術(shù)而言，X-BACS™細(xì)胞分選與激活技術(shù)具有顯著優(yōu)勢(shì)。原因之一是脂質(zhì)殼微泡幾個(gè)小時(shí)內(nèi)會(huì)完全釋放，無(wú)需在操作前后進(jìn)行微泡計(jì)數(shù)。

我們認(rèn)為CAR-TXpress™是一項(xiàng)突破性技術(shù)，具有簡(jiǎn)化生產(chǎn)工藝流程的潛力，我們期待與合作伙伴共同推進(jìn)這一技術(shù)。

Q：如果治療公司將BACS技術(shù)納入其生產(chǎn)工藝流程，是否會(huì)存在監(jiān)管障礙？

Coelho先生：每個(gè)國(guó)家都存在待解決的監(jiān)管問(wèn)題，但并非無(wú)法克服，最好的辦法是建立一個(gè)主文件（Master File）。例如，熱動(dòng)力醫(yī)療持續(xù)更新有關(guān)X-LAB™、X-WASH™和X-BACS™系統(tǒng)的主文件，涵蓋了MNC純化、靶細(xì)胞分選與激活。這個(gè)主文件包含了FDA需要的所有相關(guān)信息，作為研究人員在臨床試驗(yàn)新藥申請(qǐng)（IND）中應(yīng)用這些系統(tǒng)的參考依據(jù)。X-BACS™試劑盒也載入主文件，存入與抗體、緩沖液和微泡相關(guān)的所有信息。

這些主文件也提供細(xì)胞制品中X-BACS™試劑殘留物的信息。微泡由親和性材料制成，這些材料在后續(xù)的處理過(guò)程中（轉(zhuǎn)導(dǎo)、洗滌、擴(kuò)增、多次洗滌）會(huì)不斷減少。預(yù)計(jì)研究人員可在2019年初獲取這些主文件。

Q：很多人認(rèn)為材料供應(yīng)商單一導(dǎo)致風(fēng)險(xiǎn)較高，您認(rèn)為生產(chǎn)商應(yīng)該采取哪些措施降低這些風(fēng)險(xiǎn)？

Coelho先生：首先需要明白，我們的產(chǎn)品可作為現(xiàn)有細(xì)胞處理環(huán)節(jié)的補(bǔ)充，對(duì)潛在客戶來(lái)說(shuō)這無(wú)疑是件好事情。

況且，熱動(dòng)力醫(yī)療擁有30多年臨床細(xì)胞處理設(shè)備開(kāi)發(fā)經(jīng)驗(yàn)，所生產(chǎn)設(shè)備可重復(fù)使用數(shù)千次。因此，對(duì)于這些設(shè)備的需求，無(wú)需有采購(gòu)數(shù)量的負(fù)擔(dān)。

更重要的是，與我們的電動(dòng)設(shè)備配套使用的一次性處理套件和一次性試劑盒都能確保正常供應(yīng)，因?yàn)槲覀冋c大牌供應(yīng)商簽署長(zhǎng)期供貨協(xié)議。該供應(yīng)商信譽(yù)卓著，會(huì)按我們的要求生產(chǎn)處理套件和試劑盒，并且制定了災(zāi)難和風(fēng)險(xiǎn)緩解方案。